În Assassin's Creed 2, jucătorul işi asumă rolul lui Ezio Auditore da Firenze, un asasin din perioada renaşterii, strămoş a lui Desmond Miles. Acesta este născut şi crescut în Florenţa (Firenze), însă în joc se va deplasa şi în Tuscania (Tuscany), Veneţia (Venice), Roma (Rome), Romagna, şi în vila familiei Auditore, în Monteriggioni. jucătorul va putea folosi o gamă largă de arme, cum ar fi săbii, cuţite, cuţite pentru aruncat, 2 cuţite ascunse, un cuţit cu otravă, un pistol cu bile, topor şi suliţă, ciocane, bombe cu fum, pumni, dar şi elemente ajutătoare, cum ar fi medicină sau bani (care se pot şi arunca); pe lângă acestea, se adaugă multe abilităţi care nu au fost folosite in Assassin's Creed 1. Ezio poate umbla pe uscat, pe apă, cu barca, cu caravana sau cu un model de maşină zburătoare.
Desmond Miles, un barman din prezent a fost răpit de organizaţia templieră Abstergo şi pus în Animus, o maşină care poate citi memoriile strămoşilor din ADN. Desmond vede însă că de peste 1000 de ani există un război ascuns între templieri şi asasini, pentru a obţine un artefact mistic, Piece of Eden. Acesta decide să se alăture devizei asasinilor, iar Lucy Stillman, o angajată sub acoperire la Abstergo, îl conduce la sediul Frăţiei. Acolo, Desmond este pus în Animus 2.0, unde poate învăţa toate abilităţile strămoşilor. Personajul principal este Ezio Auditore, un asasin din sec. XV, a cărui tată şi fraţi au fost omorâţi de templieri. De atunci, Ezio caută conspiratorii responsabili pentru moartea familiei lui. Personajele din joc se regăsesc şi în realitate...
